雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒

雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒產(chǎn)品說明:

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雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒

雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒

一、標(biāo)本的采集及保存

?1.血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。?

2.血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。?

3.細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

?注：標(biāo)本溶血會影響檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

雞角膜蛋白(KERA) ELISA 試劑盒?

二、標(biāo)本的稀釋原則

? ? ? 首先通過文獻(xiàn)檢索的方式了解待測樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍內(nèi)，檢測的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的過程中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。計(jì)算濃度時，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。?

1.標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為標(biāo)準(zhǔn)濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。 如配制150 pg/ml標(biāo)準(zhǔn)品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。

2.生物素標(biāo)記抗體的稀釋原則： 臨用前以生物素標(biāo)記抗體稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記抗體加990μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。

3.辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則： 臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制。 操作步驟 實(shí)驗(yàn)開始前，請?zhí)崆芭渲煤盟性噭噭┗驑悠废♂寱r，均需混勻，混勻時盡量避免起泡。每次檢測都應(yīng)該做標(biāo)準(zhǔn)曲線。如樣品濃度過高時，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測范圍。?

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三、操作步驟

1.加樣：分別設(shè)空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。 為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請使用新的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記抗體工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記抗體加99μl生物素標(biāo)記抗體稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用前一小時內(nèi)配制），37℃,60分鐘。?

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。?

4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記抗體工作液） 100μl，37℃，60分鐘。?

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。?

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。?

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。?

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長依序測量各孔的光密度（OD值）。 在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測。?

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四、試劑盒使用小技巧

1. 用戶在初次使用試劑盒時，應(yīng)將各種試劑管離心數(shù)分鐘，以便試劑集中到管底。

2. 每次實(shí)驗(yàn)留一孔作為空白調(diào)零孔，該孔不加任何試劑，只是**加底物溶液及2N H2SO4。測量時先用此孔調(diào)OD值至零。?

3. 為防止樣品蒸發(fā)，試驗(yàn)時將反應(yīng)板放于鋪有濕布的密閉盒內(nèi)，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜。?

4. 未使用完的酶標(biāo)板或者試劑，請于2-8℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液請依據(jù)所需的量配置使用。請勿重復(fù)使用已稀釋過的標(biāo)準(zhǔn)品、生物素標(biāo)記抗體工作液或、辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液。?

5. 建議檢測樣品時均設(shè)雙孔測定，以保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。 洗板方法 手工洗板方法：吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)的液體；在實(shí)驗(yàn)臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標(biāo)板朝下用力拍幾次；將推薦的洗滌緩沖液至少0.3ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘。根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。 自動洗板：如果有自動洗板機(jī)，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實(shí)驗(yàn)過程中。 計(jì)算 以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對數(shù)坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。?

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五、技術(shù)小提示

1.當(dāng)混合蛋白溶液時應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2. 洗滌過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。?

3. 一次加樣時間**控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。?

4. 請每次測定的同時做標(biāo)準(zhǔn)曲線，**做復(fù)孔。?

5. 如標(biāo)本中待測物質(zhì)含量過高，請先稀釋后再測定，計(jì)算時請**乘以稀釋倍數(shù)。?

6. 在配制標(biāo)準(zhǔn)品、檢測溶液工作液時，請以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。?

7. 底物請避光保存。?

8. 不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。?

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六、注意事項(xiàng)

1.收集標(biāo)本前必須清楚要檢測的成份是否足夠穩(wěn)定。對收集后當(dāng)天進(jìn)行檢測的標(biāo)本，儲存在4 ℃?zhèn)溆茫缬刑厥庠蛐枰芷谑占瘶?biāo)本， 將標(biāo)本及時分裝后放在-20 ℃或-70 ℃條件下保存。避免反復(fù)凍融。

2.標(biāo)本2 -8 ℃可保存48 小時，-20 ℃可保存1 個月。-70度可保存6 個月。

3.部分激素類標(biāo)本需添加抑肽酶。?

4.計(jì)算方法：以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。?

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七、試劑盒性能

1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.92以上。

2.批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和15%?

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八、保存條件及有效期

1.試劑盒保存：2-8℃。?

2．有效期：6個月

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